Forschungsprojekt 2005

Produkt-spezifischer Assay der Aromataseaktivität

Antragsteller

Prof. Siegers

Titel

Produkt-spezifischer Assay der Aromataseaktivität

Inhalt

Das Enzym Aromatase hat für die Biosynthese von Östron und Östradiol eine herausragende Bedeutung. Andererseits ist die direkte Bestimmung der beiden Produkte schwierig, so dass die Enzymaktivität bisher mit verschiedenen Assays vorgenommen wurde:

  • Freisetzung von 3H2O aus stereospezifisch markiertem Androstendion. Dieser Assay vermag die Abnahme des Substrates zu messen, kann aber keine Aussagen über die gebildeten Produkte treffen. Nur in Systemen, in denen ausschließlich Aromatase als oxidierendem Enzym vorhanden ist kann sicher davon ausgegangen werden, dass die Geschwindigkeit der Androstendion-Abnahme der Aromataseaktivität entspricht. Dies ist z.B. in Plazentamikrosomen gegeben, sowie in artefiziellen Expressionssystemen wie Zellkulturen oder stabil transfizierten Zellen. Dagegen kann das Verhältnis des aktiven Östradiols zum inaktiven Östron nicht ermittelt werden.
  • Fluorimetrische Bestimmung mit xenogenen Substraten. Dieser Assay verwendet die Umsatzgeschwindigkeit von Benzylfluoreszein. Dieses Substrat ist nicht natürlich und hat einen hohen KM-Wert entsprechend einer geringen Affinität. Bedingt durch die hohe Störanfälligkeit der fluorimetrischen Messung kann er nur mit gereinigtem Enzym oder mit sehr gut charakterisierten Systemen wie stabil transfizierten Zellen zuverlässig durchgeführt werden, eine Verwendung dieses Assays mit Plazentamikrosomen ergibt keine reproduzierbaren Werte.

Die direkte Bestimmung der gebildeten Produkte umgeht diese Probleme. Durch den getrennten Nachweis von Östron, Östradiol und anderer Produkte kann das Produktverhältnis direkt bestimmt werden, die biologische Bedeutung der Aromataseaktivität kann aus der zu erwartenden biologischen Wirksamkeit des Östradiols abgeschätzt werden. Nach Identifizierung ist auch die Bestimmung weiterer Metaboliten, vor allem der Inaktivierung durch Sulfatierung direkt möglich. Hiermit hat ein solcher Nachweis eine breite Anwendbarkeit:

Direkter Nachweis von Aromatase durch Kopplung von Dünnschichtchromatographie und Phosphorimager-Quantifizierung

Zur Etablierung des direkten Produktnachweises wurden verschiedene Aromatasequellen mit 1,2,5,6-3H-Androstendion inkubiert (Batelle draft) und die entstandenen Produkte sowie verbliebenes Substrat extrahiert. Die Extraktionseffizienz wurde durch Bestimmung der verbleibenden Gesamtradioaktivität zu >95% bestimmt (Verbleib von <5 000 dpm Radioaktivität in der wässrigen Phase, bei einer insgesamt eingesetzten Aktivität von 0,2 μCi = 400 000 dpm). Eine Verfälschung der Ergebnisse durch die Extraktion kann damit weitgehend ausgeschlossen werden. Eine analoge Extraktion ist auch im 3H2O-basierten Nachweisverfahren enthalten, in diesem Verfahren wird darüber hinaus noch ein Aktivkohle-Filtrationsschritt verwendet, der eine weitere potentielle Fehlerquelle darstellt.

Die extrahierten Produkte wurden durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-Dünnschichtplatten (Schichtdicke des Silicagels 0,2 mm) getrennt. Die Plattenorientierung wird mit einem radioaktiven Markierungspunkt gekennzeichnet. Nach dem Auftragen und Eintrocknen der Proben wurden die Platten mit Methylenchlorid - Ethylacetat (4 : 1) bis zu einer Laufstrecke von etwa 15 cm entwickelt und die Platten getrocknet.

Die vollständig trockenen Platten wurden für drei Tage mit Tritium-sensitiven Phosphorimager-Platten exponiert. Dieses Verfahren führt bei einem radioaktiven Zerfall zur Anregung eines Y- oder Yb-Atoms, welches in der Phosphorimager-Platte enthalten ist. Dabei geht dieses Atom in einen metastabilen Zustand über, welcher eine Halbwertszeit von einigen Tagen besitzt (abhängig von Belichtung und Raumtemperatur). Durch die Exposition wird ein quantitativ korrektes Abbild der Radioaktivität von der Dünnschichtplatte auf die Phosphorimager-Platte erzeugt.

Durch Anregung mit einem Laser werden in einem Scanner die metastabilen Atome angeregt und fallen unter Emission eines Lichtquantes in den Grundzustand zurück. Durch Messung der Lichtintensität kann die in einem Areal befindliche Markierung quantifiziert werden; durch die Position des Laserstrahles wird die Phosphorimagerplatte abgetastet. Hierdurch wird die auf der Phosphorimager-Platte gespeicherte Aktivität eingelesen. Dieses Abbild kann jetzt durch Computer-basierte Verfahren nachbearbeitet werden; insbesondere ist es möglich, die in einem Spot enthaltene Radioaktivität direkt zu quantifizieren. Durch die Bestimmung der insgesamt in einer Bahn gemessenen Radioaktivität wird die Gesamtsignalintensität erhalten; die Berechnung der relativen und absoluten Produktmenge in jedem Spot ist leicht möglich.

Die Methode wurde mit Plazentamikrosomen erarbeitet. Durch Optimierung der Laufmittelzusammensetzung konnten Östron, Östradiol und Androstendion gut voneinander abgetrennt werden; durch Verlängerung der Trennstrecke oder Verwendung verbesserter Platten kann die Trennschärfe noch weiter erhöht werden.

Bisher wurde dieser Test mit gleich gutem Erfolg für Inkubationen mit Plazentamikrosomen, Lebermikrosomen sowie mit Zellkulturen durchgeführt. In allen Versuchen wurde eine gleich bleibend gute Produkttrennung erreicht, die erhaltenen Androstendion-Metaboliten unterschieden sich dabei erheblich. Während in Plazentamikrosomen sowie in MCF7-Zellen neben Östron und Östrogen nur Spuren eines weiteren, polaren Metaboliten nachgewiesen werden konnten, bildeten Lebermikrosomen ein vollständig anderes Metabolitenspektrum, entsprechend dem vorwiegend katabolen Stoffwechsel dieses Organs.

Die Sensitivität dieser Methode wird limitiert durch die spezifische Markierung der verwendeten Substrate. Kommerziell erhältliches 1,2,5,6-3H-Androstendion hat eine spezifische Aktivität von 105 Ci/mmol, die gewünschten Zielkonzentrationen (erarbeitet wurde der Assay mit einer minimalen Konzentration von 10 nmol/l) wurden durch Zusatz von unmarkiertem Androstendion eingestellt. Ohne Verwendung von unmarkiertem Substrat ist eine minimale Konzentration von 2,7 nmol/l zu erreichen; die notwendige Aktivität von 100 000 dpm ist dabei in einem Inkubationsvolumen von 750 µl enthalten. Da der KM-Wert von Aromatase für Androstendion in der Literatur zwischen 40 und 1000 nmol/l angegeben wird, erscheint eine weitere Senkung der Substratkonzentration nicht sinnvoll.

Die Spezifität dieser Methode ist durch den direkten Produktnachweis hoch. Ein Vergleich zu den bisherigen Referenzmethoden ist nicht möglich, da diese auf einem anderen Detektionsprinzip beruhen. Mit diesem Assay konnte nachgewiesen werden, das in Plazentamikrosomen bei niedrigen Substratkonzentrationen etwa gleich große Anteile der beiden Metaboliten Östradiol und Östron gebildet werden; mit steigender Androstendion-Konzentration wird dabei relativ mehr Östron als Östradiol gebildet.

Der KM-Wert der Aromatase für Androstendion wird in der Literatur zwischen 40 nmol/l und 1 000 nmol/l angegeben; unter Verwendung des Produktassays wird ein KM-Wert von 40 nmol/l erhalten, der den unteren Literaturwert bestätigt.

Die gute Hemmbarkeit der Enzamaktivität durch den Mechanismus-basierten Hemmstoff 4-Hydroxyandrostendion wurde bestätigt. Als Hemmkonstanten wurde ein IC50-Wert von 0,5 mmol/l ermittelt.

Für Aminoglutethimid, einem weiteren unspezifischen Hemmstoff der Aromatase, welches auch andere Cytochrom P450-Isoenzyme inhibiert, wird eine Hemmkonstante von 7 µmol/l ermittelt. Dieser Wert liegt im oberen Bereich der Literaturwerte, die zwischen 1 und 10 µmol/l angegeben werden.

Für den Zusatz der Substrate müssen diese in einem organischen Lösemittel zugesetzt werden. In Vorversuchen wurde eine Hemmwirkung dieser Lösemittel erhalten. Dabei Ethanol < Methanol < DMSO < Isopropanol zunahm. Daher wurde in allen Inkubationen ein Zusatz von 0,6% Ethanol verwendet, der sich als noch nicht inhibitorisch erwiesen hatte. Zur Verbesserung der Substratlöslichkeit wurden dem Inkubationsansatz 5% Propylenglykol zugesetzt, welches die Aromatase nicht hemmt, jedoch nicht als Lösemittel für die Substrate geeignet war.

Vorteile eines Produkt-basierten Aromataseassays

  • Unabhängigkeit von der Enzymquelle. Die Aromataseaktivität kann auch bei Inkubationen mit wechselnden Aromatasequellen bestimmt werden, d.h. mit variierenden Proteinkonzentrationen bzw. mit variierenden Steroidhormon-bindenden Begleitproteinen.
  • Unabhängigkeit von alternativen Stoffwechselwegen. Der Umsatz zu Östradiol und Östron ist auch bei Bildung anderer Produkte problemlos möglich. Dies wurde am Beispiel von Lebermikrosomen nachgewiesen.
  • Unabhängigkeit von der stereospezifisch notwendigen Androstendion-Tritiierung. Die Eignung des weit verbreiteten Tritium-Release-Assays beruht auf der exakten, stereospezifischen Tritiierung des Substrates. Diese Notwendigkeit ist im Produkt-basierten Assay nicht mehr gegeben, hierfür wäre die Verwendung von 14C-markierten Substraten sogar geeigneter. Da dieses Substrat jedoch nicht in hinreichenden Aktivitäten kommerziell erhältlich ist, wurden alle bisherigen Versuche ebenfalls mit tritiierten Substraten durchgeführt.
  • Direkte Bestimmung der hormonell wirksamen Aktivität. Da nur Östradiol, nicht aber Östron hormonell wirksam ist, ist das Produktverhältnis für die biologische Wirksamkeit wesentlich. Durch die direkte Östradiol-Quantifizierung ist dies möglich, im Gegensatz zum Tritium-release-Assay (Bestimmung nur des Substratumsatzes) oder des fluorimetrischen Assays (Bestimmung nur der Enzymaktivität).
  • Möglichkeit der Quantifizierung nachgeschalteter Enzymaktivitäten. Das gebildete Östradiol bzw. Östron kann durch die 17ß-HSD (17ß´-Hydroxysteroid-Dehydrogenase) ineinander umgewandelt werden. Das jeweils in einem Gewebe vorherrschende Produktmuster wird dabei durch die Isoenzymverteilung dieser Oxidoreduktase bestimmt. Dieser Stoffwechselweg ist sehr wichtig, wird aber durch andere Assays nicht erfasst. Durch die Produktisolierung ist der Einfluss der 17ß-HSD auf die Produktbildung mit erfassbar.
  • Direkte Bestimmung von Hemmstoffaktivitäten. Der Gesamteffekt von bisher charakterisierten Aromatasehemmstoffen wie 4-Hydroxaandrostendion oder Aminoglutethimid auf Aromatase und HSD wird erfasst und quantifiziert. Dies kann auch für andere Hemmstoffe durchgeführt werden. So zeigten Vorversuche mit dem Pflanzenextrakt Cimicifuga, dass durch diesen Extrakt die Aromatase nur unwesentlich beeinflusst wird, während die 17ß-HSD durch Cimicifuga deutlich gehemmt wird. Dies zeigt sich an einem fast gleich bleibenden Androstendion-Umsatz, die gebildete Östradiolmenge nimmt deutlich ab, während parallel vermehrt Östron gebildet wird.
  • Parallelbestimmung multipler Proben. Durch Dünnschichtchromatograhie können prinzipiell unbegrenzt viele Proben parallel inkubiert und analysiert werden. Auch die Exposition der Dünnschichtplatten mit Phosphorimager-Speicherplatten kann parallel erfolgen. Der Einleseschritt der Platten durch den Laserscanner selbst ist nur kurz (etwa 10 Minuten pro Platte) und erlaubt bei bis zu 30 Proben pro Platte die zügige Auswertung. Da bisher die Methodenentwicklung im Vordergrund stand, war bisher nicht die Notwendigkeit einer parallelen Analyse vieler Proben gegeben. Das Procedere lässt jedoch erkennen, dass eine Höherskalierung keine Schwierigkeiten bereiten wird.

Der neu entwickelte Assay erlaubt es, die Aromataseaktivität und ihre Produkte wesentlich besser als bisher zu charakterisieren. Es ist möglich, alle biologisch bekannten Substrate einzusetzen, solange diese in einer entsprechenden radioaktiven Markierung erhältlich sind. Durch die Unabhängigkeit von spezifischen Enzymquellen ist es jetzt ebenfalls möglich, die Enzymaktivität sowie die Produktverteilung in Gewebeproben besser als bisher möglich zu charakterisieren. Dies erlaubt es vor allem, den biologisch aktiven Anteil des Östradiols genau zu ermitteln.
Die Versatilität dieses Assays durch die Separierung der Produkttrennung vom Nachweis der Radioaktivität erlaubt eine einfache Ausweitung des Spektrums auf andere Steroidhormone. Dies könnte für die bessere Erforschung der hormonellen Beeinflussung z.B. von Prostataadenomen und Karzinomen genutzt werden.

Ausführlicher Forschungsbericht